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Desenvolvemento de novas metodoloxías analíticas para avaliar a incidencia e a estabilidade de micotoxinas do xénero Fusarium en forraxes de millo ensilados

Data: 19/05/2017

tesis

COMPOSICIÓN DO TRIBUNAL

 PRESIDENTE

Mª Fátima Alpendurada 

Química Analítica. Instituto da Agua da Regiao Norte-IAREN 

VOGAL

Jorge Eduardo Regueiro Tato 

Química Analítica e Alimentaria. Universidad de Vigo

SECRETARIA

Carmen García Jares 

Química Analítica. Universidad de Santiago de Compostela

DIRECTORES DE TESE

María Llompart Vizoso

Química Analítica. Universidad de Santiago de Compostela

Thierry Dagnac

INGACAL-CIAM

O tribunal acordou por unanimidade otorgarlle a Alicia Latorre Fernández, o título de doutor da USC, coa calificación global de “Sobresaliente” e mención de “cum laude”.

 

RESUMEN

En muchas partes del mundo, el silo de maíz es una de las más importantes fuentes de alimentación para rumiantes, constituyendo entre un 50-75% de la ingesta de materia seca en las vacas lecheras. Particularmente en Galicia, el silo es usado en más de un 50%  de las explotaciones lácteas. Por desgracia, ciertos hongos tienen la habilidad de crecer en el maíz durante su cultivo y su ensilado, produciendo unos complejos compuestos orgánicos llamados micotoxinas. Por tanto, el silo de maíz puede ser considerado como el constituyente de la ración que aporta  la mayor parte de micotoxinas ingeridas por las vacas de leche. Estas toxinas pueden ocasionar efectos perjudiciales agudos y crónicos en la salud animal y humana, y reducir la productividad en las explotaciones. 

Los datos de incidencia de micotoxinas en ensilados de maíz a nivel mundial indican que esta ruta de exposición no debe ser subestimada y que más información en este campo es necesaria. Por este motivo, el trabajo que se presenta tenía como objetivos: evaluar la incidencia y la estabilidad de micotoxinas del Fusarium en silo de maíz, optimizar y validar un método multi-micotoxinas y conocer el nivel de contaminación de micotoxinas en ensilados de maíz de Galicia.

Para conseguir el primero de los objetivos, se plantearon dos ensayos, ambos con plantas de maíz contaminadas con especies del Fusarium (hongo aislado con mayor frecuencia en maíz grano en España). La incidencia y estabilidad de las fumonisinas, del deoxinivalenol y de la zearalenona se estudiaron durante el proceso de ensilado en silos de laboratorio y en silos convencionales. En condiciones de laboratorio se evaluaron factores como el efecto del uso de inoculantes y el tiempo de ensilado,  mientras que en los silos convencionales, se estudió la localización de la muestra en el silo. También se investigó la posible ocurrencia de formas modificadas de fumonisinas. Se llevó a cabo el desarrollo de un método analítico adecuado para detectar y cuantificar las micotoxinas del Fusarium en los silos de  maíz. En silos de laboratorio, el tiempo de ensilado resultó ser un factor significativo en la evolución de la fumonisinas B1 y B2 en sus formas libres durante la segunda cosecha. El uso del inoculante Lactobacillus Buchneri tuvo efecto significativo en la estabilidad de la fumonisina B1 en su forma modificada y total (libre + modificada) para las dos fechas de cosecha. Las muestras de silo de laboratorio bajo deterioro aeróbico durante siete días mostraron niveles más altos de fumonisinas que aquellas que no habían sido expuestas al aire. Para las dos cosechas y con ambos inoculantes, el contenido de deoxinivalenol disminuyó a lo largo del proceso de ensilado, mientras que la zearalenona permaneció prácticamente constante excepto para el tratamiento con Lactobacillus Buchneri en la segunda cosecha, para el cual se observó un aumento de un 50% en la concentración de zearalenona durante el tiempo de almacenamiento. Las  mayores cantidades de fumonisinas y de zearalenona se detectaron en las capas superiores de los silos trinchera. Comparado las concentraciones de micotoxinas entre el maíz fresco y el maíz ensilado dentro de los sacos, se pudo confirmar que la tasa de disminución para la zearalenona y las fumonisinas era mayor en las partes más bajas del silo, mientras que el contenido en deoxinivalenol mostraba una mayor reducción en la capa superior de la sección inicial del silo trinchera. Los resultados obtenidos demostraron que el 65% y 39% del contenido total en fumonisina B1 and B2 en los silos de laboratorio y el 79% y 69 % del total de fumonisina B1 and B2 en silos trinchera, era debido a las formas modificadas.

La Unión Europea (UE) ha adoptado normas que limitan los niveles máximos de las micotoxinas en alimentación destinada a animales. Debido a que dichas regulaciones contemplan varias micotoxinas ya que es muy común la aparición simultánea de éstas en un mismo alimento, la Agencia Europea para la Seguridad Alimentaria (EFSA), recomienda que se desarrollen métodos multi-micotoxinas. Así, la co-ocurrencia de varias micotoxinas en ensilados crea la necesidad de que los métodos mult-micotoxinas para silos estén debidamente validados. Teniendo esto en cuenta, en esta tesis se desarrolló y validó un método multi-micotoxinas para la detección y cuantificación de micotoxinas en silo de maíz empleando la cromatografía líquida acoplada con espectrometría de masas.

Dado que la contaminación con micotoxinas en alimentos para animales puede tener una repercusión económica negativa inmediata a través del su efecto sobre la salud animal y la productividad, se debería prevenir la presencia micotoxinas en los ensilados. Por consiguiente, otro de los objetivos de este trabajo fue evaluar la contaminación de micotoxinas en 148 muestras de silos de maíz procedentes de 18 explotaciones gallegas, mediante el uso del método multi-micotoxinas validado. Un 62% de las muestras analizadas contenían al menos una micotoxina. Zearalenona, deoxinivalenol, fumonisina B1 y B2, roquefortina C, α-Zearalenol, β-Zearalenol, eniantina B y B1, andrastina A, marcfortina A, verruculogen y ácido micofenólico fueron detectados, siendo la eniantina B la más frencuente (51%) y el deoxinivalenol, ácido micofenólico, la zearalenona y sus metabolitos (α-Zearalenol, β-Zearalenol) las más abundantes.

 

JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS

      Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por ciertos  hongos pertenecientesgéneros como Fusarium, Aspergillus, Penicillum, Alternaria  y Claviceps, algunos de las cuales pueden infectar el maíz forrajero y producir micotoxinas durante el su cultivo y proceso de ensilado. Estas sustancias pueden ocasionar efectos perjudiciales agudos y crónicos sobre la salud animal y humana, y reducir la productividad en las explotaciones.

Los ensilados de maíz y de hierba son el principal forraje en la alimentación de las vacas de leche en España y, especialmente en Galicia, donde son empleados por más de 50% de las explotaciones, superando el 75% en explotaciones de mayor tamaño. En éstas, el ensilado puede constituir más de un  60% de materia seca de la ración de las vacas en lactación. El maíz forrajero es más susceptible que la hierba a la contaminación con Aspergillus y Furarium en el campo y con hongos en general en el silo. Por ello, los ensilados de maíz son el componente de la ración que aporta la mayor cantidad de micotoxinas a la dieta de las vacas de leche.

Los hongos aislados con mayor frecuencia en maíz grano en Galicia y en el resto de España son los pertenecientes al géneros Fusarium, particularmente F. verticilloides y F. proliferatum, principales productores de fumonisinas. En Galicia, también se han aislado F. graminearum y F. culmorum, productores principales de deoxinivalenol y zearalenona; y F. poae, productor principal de toxina T-2 y toxina HT-2.

Determinadas prácticas agronómicas como la rotación de cultivos, el laboreo, la elección de la fecha de siembra y cosecha, la fertilización, la elección de variedades resistentes, control de plagas y malas hierbas, pueden reducir la infección por hongos y la consecuente producción de micotoxinas, pero no erradicarlas. Los datos de incidencia de micotoxinas en ensilados de maíz en otros países, indican que la ruta de exposición debe ser considerada. Es muy frecuente la contaminación simultánea con varias micotoxinas, destacando deoxinivalenol y zearalenona, como las más habituales, además de la variación del tipo de micotoxinas y del grado de contaminación entre regiones, explotaciones de la misma región y muestras del mismo silo. Algunos de los factores determinantes en el contenido de los hongos en los silos comerciales son el lugar que ocupa la muestra en el silo, la duración de proceso de elaboración del silo y el mes que se realiza el muestreo.

Con la intención de mantener los niveles de micotoxinas por debajo de los niveles de riesgo para la salud animal, se han establecido en el ámbito de la Unión Europea (UE) una serie de normas que regulan el contenido máximo de micotoxinas en productos destinados a la alimentación animal. Así, la Comisión Europea, fija los límites máximos para la aflatoxina B1 en alimentos para animales en su directiva 2003/100/CE y aconseja además intensificar el seguimiento de la presencia de micotoxinas producidas por Fusarium en cereales y en productos a base de cereales en su Recomendación 2006/576/CE, estableciendo niveles máximos para deoxinivalenol, zearalenona, ocratoxina A y fumonisinas (suma de FB1 y de FB2) en productos destinados para animales. Más recientemente, de acuerdo con la Recomendación 2013/165/UE se establecieron los límites máximos orientativos para la suma de las toxinas T-2 y HT-2 en cereales y productos a base de cereales para alimentos y para piensos. La UE también sugiere incrementar los estudios de monitoreo de la presencia de estas micotoxinas en productos destinados a la alimentación animal y pide a sus estados miembros garantizar su análisis y facilitar regularmente sus resultados analíticos a la Comisión. Además, aparición simultánea de varias micotoxinas en un mismo alimento, unido a la variada composición de la dieta de las vacas de leche, hace que éstas estén expuestas a una mezcla variable de micotoxinas con efectos sinérgicos en algunos casos, pudiendo observarse síntomas clínicos inespecíficos capaces de desencadenar patologías comunes en vacas de alta producción. Por todo ello, la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) recomienda el desarrollo de métodos para el análisis simultáneo de múltiples micotoxinas.

La cromatografía en fase líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), debido a los niveles bajos de detección y cuantificación que permite alcanzar y a su alta repetibilidad y reproducibilidad, se presenta como una técnica eficaz que permitiría la optimización y validación de un método analítico multi-micotoxinas fiable y robusto.

Teniendo todo esto en consideración, el trabajo que se presenta se ha centrado en los siguientes objetivos:

 1. Evaluar la estabilidad de micotoxinas del genero Fusarium durante el proceso de ensilado, en silos de laboratorio y en silos convencionales. (Capítulo IV. Sección IV.A y IV.B)

 Dos ensayos se han propuesto, ambos con maíz contaminado con cepas micotoxigénicas de F. verticilloides y F. graminearum. En condiciones de laboratorio, se planteó estudiar el efecto del uso de inoculantes y la evolución del contenido de fumonisinas (F. verticilloides) y deoxinivalenol y zearalenona (F. graminearum) a lo largo del proceso de ensilado. Mientras, en los silos convencionales se evalu  la posición de la muestra en el silo. Además, también se planteó evaluar las concentraciones de fumonisinas en muestras bajo deterioro aeróbico (exposición al aire). La intención de este último estudio era conocer el contenido de esas micotoxinas en lo que sería una representación de una situación real de un silo: una vez que un silo es abierto para alimentar al ganado, se encuentra inevitablemente expuesto al aire.

Para cumplir con este objetivo, se han desarrollado metodologías de análisis (extracción, purificación y detección) para determinar la presencia de fumonisinas, deoxinivalenol y zearalenona en muestras de maíz y de silos de maíz. Así mismo, la posible presencia de micotoxinas modificadas también ha sido investigada. Para la detección y cuantificación de los compuestos se ha empleado la cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), y con detector UV/VIS por array de diodos y de fluorescencia (HPLC-PDA-FLD).

 

2. Optimización y validación de un método multi-micotoxinas utilizando la técnica
LC-MS/MS para la determinación simultánea de varias micotoxinas en muestras de ensilados de maíz.
(Capítulo IV. Sección IV.C)

 Con este objetivo se pretendía responder a las necesidades expresadas por la Comisión Europea en su recomendación 2006/576/CE sobre la presencia simultánea de diversas micotoxinas en productos destinados a alimentación animal. Las micotoxinas incluidas en el método desarrollado son las listadas a continuación: deoxinivalenol, 3 y 15 acetildeoxinivalenol, toxinas T-2 y HT-2, zearalenona, ocratoxina A, fumonisinas B1 y B2, verruculogén, ácido micofenólico, ácido penicílico, roquefortina C aflatoxinas B1 y G1, eniantina B, eniantina B1, esterigmatocistina, marcfortina A, penitrem, andrastina A, alternariol, α-zearalenol y β-zearalenol.

La técnica empleada para tal fin fue la cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), que dada su gran sensibilidad analítica, resultó ser eficaz para el desarrollo de un método analítico multi-micotoxinas fiable y robusto y que permitía cumplir con creces los límites legales/recomendados europeos acerca de los contenidos de algunas micotoxinas en productos de alimentación animal. Además, como parte del proceso de desarrollo del método analítico, varios métodos de extracción y purificación también han sido estudiados. Todo ello resultó una tarea complicada dada la complejidad de la matriz de estudio (silo) y la amplia variedad de propiedades físicas y químicas de las micotoxinas.

 

3. Evaluar la presencia y el nivel de contaminación con micotoxinas en silos de maíz de explotaciones ganaderas de Galicia. (Capítulo IV. Sección IV.D)

 La contaminación de los ensilados con micotoxinas puede tener una repercusión económica negativa a través de su efecto sobre la salud animal y la productividad. Existe poca información acerca del efecto de las técnicas de ensilado sobre su contenido en micotoxinas, lo que dificulta el definir puntos críticos de control y buenas prácticas aplicados al ensilado de maíz y mucho más difícil, que estos sean apropiados a las condiciones de las explotaciones españolas. Con este objetivo se pretendía aportar el conocimiento científico necesario para realizar un análisis y evaluación de riesgos que permitiesen proponer puntos de control durante el proceso de ensilado y definir un código de buenas prácticas.

Mediante la aplicación de método multi-micotoxinas desarrollado y validado, fue posible avanzar en el conocimiento del estado de contaminación de los ensilados con micotoxinas en explotaciones gallegas, de gran importancia en lo relativo a la seguridad alimentaria aplicada a alimentos para la ganadería. Además, desde el punto de vista práctico, el uso de métodos multi-micotoxinas supone un importante ahorro en trabajo, tiempo y dinero para los laboratorios de análisis y autoridades sanitarias, proporcionando información sobre una amplia variedad de micotoxinas en alimentos para animales. Toda esta información podría ser utilizada en la elaboración de futuras normas y procedimientos prácticos que asegurasen la calidad de los productos.

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